ISO 15141:2018

NORME ISO
INTERNATIONALE 15141
Première édition
2018-07
Céréales et produits céréaliers —
Dosage de l'ochratoxine A — Méthode
par chromatographie en phase liquide
à haute performance avec purification
sur colonne d'immunoaffinité et
détection par fluorescence
Cereals and cereal products — Determination of ochratoxin A — High
performance liquid chromatographic method with immunoaffinity
column cleanup and fluorescence detection
Numéro de référence
ISO 15141:2018(F)
©
ISO 2018

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ISO 15141:2018(F)

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publication ne peut être reproduite ni utilisée sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique,
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Publié en Suisse
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Sommaire Page
Avant-propos .iv
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions . 1
4 Principe . 1
5 Réactifs . 2
6 Appareillage et équipement . 4
7 Mode opératoire. 5
7.1 Généralités . 5
7.2 Échantillonnage . 5
7.3 Préparation des échantillons pour essai . 5
7.4 Extraction de l'ochratoxine A de l'échantillon . 5
7.4.1 Extraction . 5
7.4.2 Dilution. 5
7.5 Purification sur colonne d’immunoaffinité . 5
7.6 Conditions de fonctionnement de la CLHP . 6
7.7 Courbe d’étalonnage . 6
7.8 Identification . 6
7.9 Détermination . 6
7.10 Confirmation . 7
8 Calculs . 7
9 Fidélité . 8
9.1 Généralités . 8
9.2 Répétabilité . 8
9.3 Reproductibilité . 8
10 Rapport d'essai . 8
Annexe A (informative) Résultats des essais interlaboratoires . 9
Bibliographie .12
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Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude
a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux.
L'ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui
concerne la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier, de prendre note des différents
critères d'approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été
rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir www
.iso .org/directives).
L'attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour responsable
de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant
les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de
l'élaboration du document sont indiqués dans l'Introduction et/ou dans la liste des déclarations de
brevets reçues par l'ISO (voir www .iso .org/brevets).
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un
engagement.
Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions
spécifiques de l'ISO liés à l'évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l'adhésion
de l'ISO aux principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles
techniques au commerce (OTC), voir le lien suivant: www .iso .org/iso/fr/avant -propos .html.
Le présent document a été élaboré par le comité technique ISO/TC 34, Produits alimentaires, Sous-
comité SC 4, Céréales et légumineuses.
Cette première édition annule et remplace l'ISO 15141-1:1998 et l'ISO 15141-2:1998 qui ont fait l’objet
d'une révision technique.
Le principal changement par rapport à l’édition précédente réside dans le fait que le principe de
l’extraction et de la purification a été modifié.
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Céréales et produits céréaliers — Dosage de l'ochratoxine
A — Méthode par chromatographie en phase liquide
à haute performance avec purification sur colonne
d'immunoaffinité et détection par fluorescence
1 Domaine d’application
Le présent document expose en détail une méthode par chromatographie liquide à haute performance
avec purification sur colonne d’immunoaffinité pour le dosage de l’ochratoxine A dans les céréales et les
produits céréaliers.
Le seuil de quantification est de 0,2 μg/kg. La limite de la méthode de détection dépend de la matrice de
l’échantillon ainsi que de l’instrument.
2 Références normatives
Les documents suivants cités dans le texte constituent, pour tout ou partie de leur contenu, des
exigences du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique. Pour les
références non datées, la dernière édition du document de référence s'applique (y compris les éventuels
amendements).
ISO 3696, Eau pour laboratoire à usage analytique — Spécification et méthodes d’essai
3 Termes et définitions
Aucun terme n'est défini dans le présent document.
L'ISO et l'IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en
normalisation, consultables aux adresses suivantes:
— ISO Online browsing platform: disponible à l'adresse http: //www .iso .org/obp
— IEC Electropedia: disponible à l'adresse http: //www .electropedia .org/
4 Principe
L'ochratoxine A (OTA) est extraite par un mélange acétonitrile/eau. L'extrait est purifié en utilisant
une colonne d’immunoaffinité, et l'ochratoxine A est déterminée par chromatographie liquide à haute
performance sur colonne en phase inverse, avec détection par fluorescence. Le résultat peut être vérifié,
si nécessaire, par dérivation avec du trifluorure de bore en solution dans du méthanol.
AVERTISSEMENT — L'ochratoxine A provoque des lésions au niveau des reins et du foie, et elle
[1]
est probablement cancérigène. Il est nécessaire de respecter les précautions de sécurité lors
des manipulations de ce produit et d’éviter notamment toute manipulation du produit sous
forme déshydratée du fait de sa nature électrostatique qui peut occasionner une dispersion
et une inhalation. Il est possible de décontaminer la verrerie avec une solution d'hypochlorite
de sodium à 4 %. L’attention du lecteur est attirée sur la déclaration formulée par l'Agence
[2][3]
Internationale de Recherche sur le Cancer (OMS) .
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5 Réactifs
Au cours de cette analyse et sauf indication contraire, utiliser uniquement des réactifs de qualité
analytique reconnue et de l'eau distillée de qualité 1, conformément à l'ISO 3696. Les solvants doivent
être de qualité pour analyse CLHP.
5.1 Acétonitrile.
5.2 Méthanol.
5.3 Chlorure de sodium (NaCI).
5.4 Acide acétique glacial, φ(CH3COOH) ≥ 98 %.
5.5 Tween 20.
5.6 Bicarbonate de sodium (NaHCO ).
3
5.7 Hydrogénophosphate de sodium (Na HPO ).
2 4
5.8 Dihydrogénophosphate de potassium (KH PO ).
2 4
5.9 Chlorure de potassium (KCI).
5.10 Acide chlorhydrique, c(HCl) =12 mol/l.
5.11 Ochratoxine A, sous forme de cristaux ou de film en ampoule.
5.12 Solvant d'extraction, mélanger 60 volumes d’acétonitrile (5.1) et 40 volumes d’eau.
5.13 Tampon phosphate salin (tampon PBS), dissoudre 8 g de NaCl (5.3), 1,2 g de Na HPO (5.7),
2 4
0,2 g de KH PO (5.8) et 0,2 g de KCl (5.9) dans environ 990 ml d’eau. Ajuster le pH à 7 avec du HCI (5.10)
2 4
et compléter à 1 l avec de l'eau.
5.14 Solution de lavage, dissoudre 25 g de NaCl (5.3), 5 g de NaHCO (5.6) et 0,1 ml de Tween 20 (5.5)
3
dans 1 l d’eau.
5.15 Phase mobile, mélanger 48 volumes d’acétonitrile (5.1), 51 volumes d’eau et 1 volume d’acide
acétique glacial (5.4). Dégazer cette solution avant utilisation.
5.16 Toluène.
5.17 Mélange de solvants, mélanger 99 volumes de toluène (5.16) avec 1 volume d'acide acétique
glacial (5.4).
5.18 Solution-mère d'ochratoxine A
Dissoudre 1 mg d'ochratoxine A (cristaux) (5.11) ou le contenu d’une ampoule (si l’ochratoxine A est
sous forme de film) (5.11) dans le mélange de solvants (5.17) pour obtenir une solution contenant
environ 20 μg/ml à 30 μg/ml d’ochratoxine A.
Pour déterminer la concentration exacte, enregistrer la courbe d’absorption entre une longueur d’onde
de 300 nm et 370 nm par pas de 5 nm dans une cuve en quartz de 1 cm (6.12) avec le mélange de
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solvants (5.17), comme référence. Identifier la longueur d'onde de l'absorption maximale en effectuant
un enregistrement par palier de 1 nm autour du maximum comme référence. Calculer la concentration
massique d’ochratoxine A, ρ , exprimée en microgrammes par millilitre de solution, à l'aide de la
OTA
Formule (1):
M×100
ρ =×A (1)
OTAmax
K×δ
où
A est l'absorbance déterminée au maximum de la courbe d'absorption (ici: à 333 nm);
max
M est la masse moléculaire relative de l'ochratoxine A (M = 403 g/mol);
κ est le coefficient d'absorption moléculaire de l'ochratoxine A, dans le mélange de solvants
2
(ici: 544 m /mol);
δ est la longueur du trajet optique de la cellule, en centimètres.
Stocker cette solution à une température d’environ -18 °C. Une solution stockée dans ces conditions
peut généralement rester stable pendant 12 mois. Contrôler la concentration de la solution si celle-ci
date de plus de 6 mois.
5.19 Solution étalon d’ochratoxine A, ρ =1 μg/ml.
OTA
Évaporer jusqu’à siccité sous courant d'azote 1 ml de la solution-mère (5.18) ou la portion aliquote qui
est équivalente à 100 μg d'ochratoxine A en valeur absolue, puis diluer jusqu’à 100 ml avec la phase
mobile (5.15).
Cette solution peut être stockée dans un réfrigérateur à 4 °C. La stabilité doit être vérifiée.
5.20 Solutions d'étalonnage d'ochratoxine A
Pipeter des volumes adéquats de la solution étalon d’ochratoxine A (5.19), par exemple 0,05 ml, 0,1 ml,
0,25 ml, 0,5 ml et 1 ml dans une fiole jaugée de 100 ml par exemple (6.15), et diluer en complétant
jusqu'au trait de jauge avec de la phase mobile (5.15). Il convient que la teneur en ochratoxine A des
solutions d'étalonnage couvre la gamme de 0,05 ng à 1,0 ng pour 100 µl de volume d'injection. Il est
recommandé de préparer les solutions d’étalonnage extemporanément à partir de la solution étalon
d’ochratoxine A (5.19) avant chaque analyse CLHP.
5.21 Solution d'hypochlorite de sodium, ρ(NaOCl) = 4 g/100 ml.
5.22 Trifluorure de bore.
5.23 Trifluorure de bore en solution dans le méthanol, ρ(BF ) = 14 g/100 ml.
3
5.24 Dichlorométhane
5.25 Sulfate de sodium, anhydre.
5.26 Solvant d'élution, mélanger 98 volumes de méthanol (5.2) et 2 volumes d’acide acétique
glacial (5.4).
AVERTISSEMENT — Utiliser une hotte d'extraction en bon état de fonctionnement. Éviter le
contact avec la peau, les yeux et les voies respiratoires.
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6 Appareillage et équipement
Appareillage courant de laboratoire et, en particulier, ce qui suit:
6.1 Balance analytique, d’une précision de 10 mg.
6.2 Mixeur, avec un bol de 1 l et un couvercle, antidéflagrant.
6.3 Papier filtre,
a) Papier filtre plissé, ou
b) Filtre en microfibres de verre.
6.4 Tube à centrifuger, de 50 ml.
6.5 Filtre à membrane pour solutions aqueuses, en polytétrafluoroéthylène (PTFE), de 25 mm de
diamètre et de 0,2 µm de porosité.
6.6 Colonne d’immunoaffinité, qui doit contenir des anticorps dirigés contre l’ochratoxine A,
1)
®
ToxinFast colonne d’immunoaffinité d’ochratoxine A (Huaan Magnech) ou l'équivalent.
6.7 Seringue en verre, de 10 ml.
6.8 Pompe à vide.
6.9 Évaporateur rotatif, avec bain-marie, pouvant être régulé entre 20 °C et 50 °C.
6.10 Broyeur de laboratoire, prévu pour broyer jusqu'à 1 mm.
6.11 Spectromètre UV, pouvant effectuer des mesurages dans les longueurs d'onde comprises entre
300 nm et 370 nm, d'une largeur de bande spectrale ne dépassant pas ± 2 nm.
6.12 Cuves en quartz, d'une longueur de trajet optique de 1 cm et sans absorption significative entre
les longue
...